1ère Journée d'Étude sur la Marmotte Alpine, Ramousse R. & Le Berre M. eds. : 81-88.

Régulation saisonnière du métabolisme lipidique chez la marmotte Alpine Marmota marmota

Nathalie COCHET, Roger MEISTER, Gabriel CROUZOULON &
Hervé BARRE

De par sa masse corporelle relativement importante (environ 5 kg), la marmotte alpine (Marmota marmota ) se classe parmi les mammifères hibernants de grande taille. Cet animal présente au cours de son cycle saisonnier une remarquable capacité de gestion de ses réserves lipidiques. En effet, durant la période estivale, la marmotte alpine accroît rapidement sa masse corporelle, ce qui implique une forte activité lipogénique (accumulation importante de triglycérides dans le tissu adipeux blanc). A la fin de l'été, ces réserves représentent environ 1/3 de la masse corporelle. Au début de l'automne, la marmotte entre spontanément dans une période de jeûne qui se prolonge durant les 5 à 6 mois que dure l'hibernation et mâme au-delà. Les réserves endogènes seront consommées progressivement lors de la période d'hibernation et de jeûne, notamment au cours des réveils périodiques d'hibernation durant lesquels l'animal doit momentanément faire face à une demande d'énergie considérable. En effet, il lui faut rétablir sa normothermie (réchauffement du corps initialisé dans le tissu adipeux brun, présent chez les mammifères hibernants), relancer tous les processus physiologiques et maintenir pendant plusieurs heures un niveau métabolique élevé.
Les recherches proposées dans le cadre du programme "Marmotte alpine" portent sur l'aspect saisonnier de la régulation du métabolisme lipidique chez cet animal. Cet aspect comprend trois volets principaux.


1. EVOLUTION SAISONNIERE DES ACTIVITES LIPOLYTIQUE ET LIPOGENIQUE DU TISSU ADIPEUX BLANC DE MARMOTA MARMOTA


La régulation du cycle lipolyse-lipogenèse, très efficace chez ce mammifère, est encore de nos jours peu connue. L'objectif de ces recherches est d'étudier le rôle des hormones les plus probablement impliquées dans cette régulation, ainsi que celui d'un médiateur local, l'adénosine.

1.1. Protocole expérimental

L'étude des activités lipolytique et lipogénique sera effectuée suivant une méthode in vitro, sur deux lots d'animaux. Le premier lot est placé au cours de l'hiver, dans une chambre obscure tempérée à 7°C, sans eau ni nourriture. Le deuxième est gardé à 18°C sous une photopériode naturelle, l'eau et la nourriture étant fournies ad libitum. Un fragment de tissu adipeux blanc, prélevé dans la région abdominale de l'animal, sera soumis à l'action digestive d'une collagénase (suivant un protocole expérimental décrit par Rodbell, 1964) et incubé directement en présence des hormones classiquement connues comme régulant ces deux processus chez les mammifères (cf §1.2). Cette méthode permettra, au cours des saisons, d'évaluer la sensibilité des adipocytes à chacun des différents facteurs utilisés. L'activité lipolytique sera mesurée par dosage du glycérol (résultant de l'hydrolyse des triglycérides) relargué dans le milieu d'incubation sous l'action de ces hormones. L'incorporation d'eau tritiée dans les lipides neutres (acides gras et triglycérides) permettra d'estimer l'activité lipogénique des cellules adipeuses, en présence ou non des différents agents choisis.
La nécessité de travailler suivant une technique standardisée nous a conduit à la mise au point préalable d'une méthode chez le rat. Cette méthode sera transposée chez la marmotte. Les activités lipolytique et lipogénique seront mesurées simultanément chez chaque animal, au cours d'un cycle saisonnier complet .

1.2. Régulation hormonale des processus de lipolyse et de lipogenèse

Chez les mammifères, les catécholamines (adrénaline et noradrénaline) sont les médiateurs privilégiés de la lipolyse. Chez les hibernants, elles jouent en outre un rôle important dans la modulation de la prise alimentaire (chez Eliomys quercinus L., Ambid et al., 1990) et la stimulation des processus de thermogenèse sans frisson, lors des réveils périodiques. Le taux de catécholamines plasmatiques varie suivant les phases du cycle d'hibernation. Durant l'entrée en hibernation et l'hibernation profonde de Marmota monax, les taux plasmatiques de noradrénaline et d'adrénaline sont faibles et variables. En revanche, les concentrations de ces hormones augmentent considérablement dans le plasma lors des phases de réveil périodique et présentent un pic maximal lorsque la température corporelle (Tb) de l'animal atteint 25 °C (Florant et al., 1982).
D'autre part, des études réalisées chez le Loir (Glis glis) et le Hérisson (Erinaceus europaeus) ont montré que la mobilisation des substrats énergétiques semble soumise à l'action du couple glucagon-insuline. Pendant l'hibernation, la sécrétion de ces deux hormones est thermosensible. Elle est notamment réduite en dessous d'une Tb de 15°C. Au niveau du tissu adipeux blanc, l'insuline présente une action antilipolytique et stimulatrice de la lipogenèse en favorisant le transport du glucose à l'intérieur de l'adipocyte. A l'inverse, le glucagon permet la mise à disposition de substrats énergétiques (tels que le glucose et les acides gras) dont l'utilisation par les tissus est à son tour favorisée par l'insuline, et participe à l'activation des mécanismes de restauration des réserves glucidiques par néoglucogenèse, lors du jeûne prolongé. Les substrats libérés alimentent également les cellules musculaires squelettiques, siège de la thermogénèse de frisson, survenant en fin de réveil périodique (Castex et Hoo-Paris, 1987). D'autres études menées par Florant et al. (1991) ont montré une élévation saisonnière de l'insulinémie et de la glycémie, en automne, période pendant laquelle les marmottes cessent spontanément de s'alimenter. Cette observation suggère une forte insulino-résistance des tissus de stockage des réserves (foie, muscles squelettiques, tissu adipeux blanc) et une réduction probable de l'activité lipogénique.
De mâme, l'hormone corticotrope (ACTH) montre une activité lipolytique comparable, voire supérieure, à celle des catécolamines chez le rat (Heerden and Oelofsen, 1989). Cette hormone est connue pour intervenir dans le métabolisme glucidique et la mobilisation rapide d'énergie (situation de stress). Armitage (1991) a montré une augmentation du taux plasmatique des corticostéroïdes (stimulés par l'ACTH) au cours du cycle naturel de Marmota flaviventris. Ces variations semblent liées à l'âge des individus, à la densité de population des colonies ainsi qu'aux interactions sociales entre les marmottes, à différentes périodes de la saison estivale. Ces variations sont-elles le reflet d'un cycle endogène persistant chez les animaux en captivité ?
Catécholamines, glucagon, insuline et ACTH seront les principales hormones étudiées lors de l'étude des activités lipolytique et lipogénique.

L'action d'autres facteurs lipolytiques tels que les hormones thyroïdiennes et les stéroïdes sexuels (oestradiol et testostérone) sera également envisagée. Le pouvoir activateur du métabolisme de la cellule adipeuse par la T3 a été de nombreuses fois montré in vivo, sur des sujets présentant des cas d'hypo ou d'hyperthyroïdisme. Young et al. (1986) ont mis en évidence chez Marmota monax une élévation du taux d'hormones thyroïdiennes T3 (tri-iodothyronine) et T4 (thyroxine) qui débute en automne et se poursuit au cours de la période hivernale. Une évolution inverse a été observée chez Marmota marmota, en captivité. En effet, Saboureau a montré dans une étude récente que le taux de T4 (précurseur de l'hormone T3) décroît au cours de la saison d'hibernation et augmente à la sortie de l'hibernation jusqu'à la fin de l'été (1992, non publié).
Nous rechercherons un effet de cette hormone dans la régulation du cycle lipolyse-lipogenèse chez la marmotte alpine.

Les stéroïdes sexuels augmentent de façon importante l'activité lipolytique d'adipocytes blancs de rat, en présence ou non de noradrénaline. A l'inverse, une forte dépression de l'activité lipolytique due à l'absence d'androgènes et d'oestrogènes chez des rats castrés ou ovariectomisés a été montrée par Guidicelli et al. (1993). Des variations annuelles de la testostéronémie, concomitantes du cycle lipolyse-lipogenèse, ont été mises en évidence chez le hérisson mâle (Saboureau & Boissin,1983 ; Saboureau, 1984). Une testostéronémie élevée pendant la saison d'hibernation (3 à 4 ng / ml) et faible (concentration inférieure à 1 ng / ml) durant la saison estivale a été également mise en évidence chez Marmota monax par Baldwin et al. (1985). Selon ces auteurs, le cycle de la testostéronémie ne semble pas altéré par l'absence d'hibernation et la captivité. Ici encore, une étude menée chez Marmota marmota montre une évolution inverse du cycle annuel de la testostéronémie. En effet, le taux plasmatique de testostérone durant la saison d'hibernation reste faible (0,4 ng / ml), double rapidement à la sortie de l'hibernation (mars, 1ng / ml) et se maintient à un niveau élevé jusqu'au milieu de l'été (Saboureau, 1992, non publié). Aucune équivalence n'a pu âtre mise en évidence concernant les variations du cycle de l'oestradiol chez la femelle de Marmota marmota.
L'évolution parallèle des concentrations plasmatiques de la T3 et de la testostérone, au moment où les marmottes, alors sorties d'hibernation, continuent leur jeûne hivernal, suggère que ces hormones jouent un rôle important dans la mobilisation des dernières réserves énergétiques.

1.3. Rôle d'un médiateur local : l'adénosine

Cette molécule ubiquitaire libérée par les cellules en diverses circonstances (déficit en ATP ou en oxygène, dégradation des nucléotides adényliques intracellulaires) agit sur des récepteurs cellulaires spécifiques dont plusieurs types ont déjà été décrits (Stiles, 1992). Le premier effet de l'adénosine concerne l'amélioration du flux sanguin dans les tissus (vasodilatation). Par ailleurs, l'action antilipolytique de cette molécule endogène est bien établie mais très mal comprise. Certains travaux actuels portent sur son rôle dans l'obésité chez l'homme (Kather et al., 1985), d'autres sur son pouvoir dépresseur de la température corporelle lors d'une exposition au froid (Wang et al., 1992). Le rôle de l'adénosine au niveau adipocytaire sera abordé par l'étude in vitro de deux molécules : l'adénosine désaminase, enzyme qui dégrade in situ l'adénosine et le N6-phénylisopropyladénosine (PIA), agoniste non métabolisable de l'adénosine. La sensibilité à l'adénosine du cycle lipolyse-lipogenèse des adipocytes isolés sera étudiée aux différentes saisons.


2. EVOLUTION SAISONNIERE DE LA COMPOSITION DU TISSU ADIPEUX BLANC DE MARMOTA MARMOTA

Cette deuxième partie s'intéressera plus particulièrement à l'évolution saisonnière de la composition en acides gras (AG) du tissu adipeux blanc de la marmotte alpine. Les acides gras qui entrent dans la composition de nombreuses structures cellulaires de mammifères, ne peuvent pas tous âtre élaborés par l'organisme lui-mâme. Certains, dont les acides gras saturés (acides palmitique et stéarique) ou monoinsaturés (acide oleïque) sont synthétisés de novo dans le foie et/ou dans le tissu adipeux, suivant le mammifère considéré. D'autres, tels que les acides gras polyinsaturés, appelés encore "acides gras essentiels", ne peuvent âtre synthétisés par les cellules mammaliennes et doivent impérativement âtre fournis par la nourriture.
Chez les hibernants, les acides gras assurent une double fonction. Ils constituent le principal carburant énergétique utilisé intensivement lors du jeûne prolongé qui accompagne la saison d'hibernation. Certains d'entre eux, les acides gras polyinsaturés, sont nécessaires pour l'édification des membranes cellulaires. Le degré de fluidité des membranes, dépendant de la teneur en acides gras polyinsaturés, pourrait intervenir dans la durée des phases d'hibernation, sur l'abaissement de la température corporelle et dans le métabolisme à basse température (Geiser & Kenagy, 1987).

Florant et al (1990) ont étudié la composition en acides gras du tissu adipeux blanc de Marmota flaviventris ainsi que celle des végétaux consommés préférentiellement par cette espèce. Chez les animaux en captivité, la composition en acides gras du tissu adipeux est uniforme entre les différents dépôts, tous constitués à 95 % d'acides gras saturés, mono (monoènes) et diinsaturés (diènes). Le tissu adipeux des animaux fraîchement capturés a un pourcentage non négligeable d'acide linolénique (triinsaturé). Ce pourcentage décroît lorsque l'animal est maintenu un certain temps sous un régime alimentaire de laboratoire. Selon Florant et al., certains acides gras semblent préférentiellement utilisés pendant l'hibernation. Le pourcentage des saturés décroît au cours de l'hibernation alors que celui des monènes et diènes tend à augmenter dans le tissu adipeux, en fin d'hibernation.

Pour notre part, nous nous intéresserons à la nature des acides gras libérés au cours de la lipolyse, en fonction de la saison. L'étude sera conduite selon le protocole exposé dans le paragraphe 1.1. Le profil de ces acides gras libérés dans le milieu d'incubation sera comparé à celui des acides gras contenus dans le tissu entier de départ et rapporté à celui des acides gras contenus dans la nourriture de laboratoire.


3. VARIATIONS SAISONNIERES DU TRANSPORT DU GLUCOSE A TRAVERS LA MEMBRANE ADIPOCYTAIRE

Le glucose est le principal précurseur de la lipogenèse. Chez les mammifères, l'utilisation du glucose par les adipocytes est limitée non pas par les enzymes clés des séquences métaboliques, mais par l'entrée du glucose à travers la membrane plasmique (James et al., 1989). D'autre part, les travaux de Omatsu-Kambe et Kitasato (1992) montrent que les mécanismes d'activation de la thermogénèse peuvent impliquer la stimulation du transport du glucose (dans le tissu adipeux brun). Nous nous proposons de vérifier si l'augmentation du transport et/ou sa sensibilité à l'insuline est synchrone des périodes de thermogénèse (durant l'hibernation) et de lipogenèse (durant la saison estivale).

Le glucose plasmatique traverse la membrane des cellules par transport facilité, suivant son propre gradient de concentration. Deux transporteurs coexistent dans les tissus sensibles à l'insuline :
- GLUT1, transporteur ubiquitaire, assurant le transport de base du glucose à travers la membrane d'un grand nombre de cellules (rôle minime dans l'adipocyte).
- GLUT4, transporteur principal, stocké au niveau de sites intracellullaires, insulino-dépendant et distribué dans le tissu adipeux blancs, les muscles squelettique et cardiaque (Assimacopoulos-Jeannet et al. , 1991).
Dans le tissu adipeux blanc, l'insuline régule positivement le nombre de transporteurs GLUT4, en accélérant leur translocation depuis le réticulum endoplasmique vers la membrane plasmique (réponse à court terme), puis en augmentant la synthèse d'ARNm codant pour la séquence peptidique de GLUT4 (réponse à long terme).

Notre objectif est de décrire l'évolution saisonnière de la vitesse de transport du glucose à travers la membrane de l'adipocyte de marmotte ainsi que la sensibilité à l'insuline de ce transport. Pour cela les caractéristiques cinétiques (Vmax et Km) seront déterminées et un dénombrement des transporteurs sera réalisé.
Ces mesures nécessiteront l'emploi d'un analogue non métabolisable du glucose : le 3-O-méthyl D glucose radioactif (3-[14C]OMG) qui utilise les mâmes transporteurs que le glucose (GLUT1 et GLUT4) et permet l'étude du transport des sucres en tant que tel, c'est-à-dire affranchi de l'influence du métabolisme. Le 3-OMG est transporté suivant son gradient de concentration et cesse de s'accumuler dans la cellule lorsque l'équilibre de diffusion est atteint.
Les transporteurs seront dénombrés grâce à l'utilisation de cytochalasine B radioactive, ligand spécifique des transporteurs du glucose.
La sensibilité à l'insuline sera estimée par l'augmentation du transport sous l'effet d'une concentration préétablie et constante de l'hormone.


BIBLIOGRAPHIE

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Remerciements
Ce travail a été réalisé grâce au soutien financier du Ministère Français de l'Environnement (Contrat EGPN) et du Ministère de la Recherche (contrat CNRS, Programme Environnement). Il a pu se dérouler grâce au soutien actif des administrations et des agents du Parc National des Ecrins et de la Vanoise, que nous tenons à remercier.

A suivre...

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